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TitleMouse Cell Culture: Methods and Protocols
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LanguageEnglish
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Page 2

METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY
TM

Series Editor
John M. Walker

School of Life Sciences
University of Hertfordshire

Hatfield, Hertfordshire, AL10 9AB, UK

For other titles published in this series, go to
www.springer.com/series/7651

Page 131

124 Brand et al.

E., Slonimsky, E., Salimova, E., Delafontaine,
P., Song, Y. H., Bergmann, M., Freund,
C., Suzuki, K., and Rosenthal, N. (2007)
Enhancing repair of the mammalian heart.
Circ. Res. 100, 1732–1740.

8. Sasse, S., Brand, N. J., Kyprianou, P., Dhoot,
G. K., Wade, R., Arai, M., Periasamy, M.
et al. (1993) Troponin I gene expres-
sion during human cardiac development and
in end-stage heart failure. Circ. Res. 72,
932–938.

9. Bhavsar, P. K., Brand, N. J., Yacoub, M. H.,
and Barton, P. J. (1996) Isolation and char-
acterisation of the human cardiac Troponin I
gene. Genomics 35, 11–23.

10. Bhavsar, P. K., Dellow, D. A., Yacoub, M.
H., Brand, N. J., and Barton, P. J. R. (2000)
Identification of cis-acting elements required

for expression of the human cardiac troponin
I gene promoter. J. Mol. Cell. Cardiol. 32,
95–108.

11. Dellow, K. A., Bhavsar, P. K., Brand, N. J.,
and Barton, P. J. R. (2001) Identification of
novel, cardiac-restricted transcription factors
binding to a CACC-box within the human
cardiac Troponin I promoter. Cardiovasc.
Res. 50, 24–33.

12. Iwaki, K., Sukhatme, V. P., Shubeita, H. E.,
and Chien, K. R. (1990) Alpha- and beta-
adrenergic stimulation induces distinct pat-
terns of immediate early gene expression in
neonatal rat myocardial cells. fos/jun expres-
sion is associated with sarcomere assem-
bly; Egr-1 induction is primarily an alpha
1-mediated response. J. Biol. Chem. 265,
13809–13817.

Page 132

Chapter 10

Short- and Long-Term Cultivation of Embryonic
and Neonatal Murine Keratinocytes

Reto Caldelari and Eliane J. Müller

Abstract

Studies using cultured cells allow one to dissect complex cellular mechanisms in greater detail than when
studying living organisms alone. However, before cultured cells can deliver meaningful results they must
accurately represent the in vivo situation. Over the last three to four decades considerable effort has been
devoted to the development of culture media which improve in vitro growth and modeling accuracy. In
contrast to earlier large-scale, non-specific screening of factors, in recent years the development of such
media has relied increasingly on a deeper understanding of the cell’s biology and the selection of growth
factors to specifically activate known biological processes. These new media now enable equal or better
cell isolation and growth, using significantly simpler and less labor-intensive methodologies. Here we
describe a simple method to isolate and cultivate epidermal keratinocytes from embryonic or neonatal
skin on uncoated plastic using a medium specifically designed to retain epidermal keratinocyte progenitors
in an undifferentiated state for improved isolation and proliferation and an alternative medium to support
terminal differentiation.

Key words: Serum-free mouse keratinocyte cultures, CnT culture conditions, keratinocyte
progenitor cells, feeder-free keratinocyte cultures.

1. Introduction

As the dominant cell type of the epidermis, keratinocytes drive the
perpetual renewal of the outermost layer of the skin. They arise
from mitotic division of epidermal progenitor or stem cells to
then go on to build up the stratified epithelium by proliferation

The last author would like to state that she is a co-founder and the presi-
dent of the Board of CELLnTEC, Advanced Cell Systems AG.

A. Ward, D. Tosh (eds.), Mouse Cell Culture, Methods in Molecular Biology 633,
DOI 10.1007/978-1-59745-019-5_10, © Springer Science+Business Media, LLC 2010

125

Page 261

256
MOUSE CELL CULTURE
Subject Index

Muscle
cardiac . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102, 114
skeletal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29–55, 101–110

Myf-5 . . . . . . . . . . . . . . . . . 30, 36, 41, 43, 47–48, 50, 54, 102
Myoblast . . . . . . . . . . . 30–31, 33, 42, 53, 102, 107, 109–110
Myocardium. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
Myocytes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114, 119–121
MyoD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43, 47, 102–103, 108, 110
Myofibres . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102, 104, 106
Myogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
Myogenic determination factor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
Myogenin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
Myosin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101, 108, 110
Myotome. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30
Myotube . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36–37, 51, 54, 107–108

N

Neomycin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
Neonates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114, 116, 122, 129, 204, 218
Nervous system . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 207, 221, 234
Nestin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 242
Neural stem cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 242
Neurogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 241
Neuronal tissue . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19, 241
Neurons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30, 221–231, 233–234, 242
Neurosphere . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 241–251
Neurotrophin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221
Notochord . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92–93

O

Oct4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2, 9–10
Oesophagus. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .81–89, 93
Oligodendrocytes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222
Optimal cutting compound (OCT) . . . . . . . . . . . . . . . 89, 135
Organ culture

lung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
mouse embryonic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

mammary epithelium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146
organoid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146–148

renal, see Kidney
tissue recombination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72, 198

Organ development, see Organogenesis
Organogenesis

branching morphogenesis . . . . . . . . . . . . . . 57, 71–79, 91
epithelial-mesenchymal interactions . . . . . . . . . . . . . . . 72

kidney (renal) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57–69
induction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

metanephric/metanephrogenic
mesenchyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64–65

ureteric bud . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59, 61, 64
Wolffian duct . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61–62

lung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
specification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92, 101

mammary gland
alveolar . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 161, 167
involution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140

mesenchyme-epithelial transition . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
myogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
neurogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 241

Oxytocin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 140

P

p57 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
Pancreas . . . . . . . . 3, 82, 86, 91–98, 172–176, 178, 182–183

Pancreatic polypeptide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93, 171
Pancreatin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114–116, 122
Paneth cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83, 197
Paraformaldehyde . . . . . . . . . . . . 35–36, 49, 51, 54, 135, 168,

211, 215, 224
Passage . . . . . . . . . . 7, 9, 14, 21, 64, 123, 126–127, 131–133,

136, 148, 164, 211, 230, 246, 248–250
Pax3, 102, 107
Pax7, 102, 107
Penicillin . . . . . . . . . . . . . 6, 13, 21–22, 33–34, 59, 63, 73, 76,

84, 103–104, 114, 128, 140–141, 172–173, 177,
179, 191–192, 198–199, 210

Pharynx . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75–76, 86
Phosphate buffered saline (PBS) . . . . 5, 7–9, 13, 21–24, 32,

35–36, 38–39, 44, 46, 49–51, 54, 58–59, 63, 73,
83, 93–96, 103, 109, 128, 131, 133, 135,
141–142, 145, 152–155, 157, 159, 168,
191–192, 199, 203–204, 211, 214–217, 224,
228, 243, 251

Phospho-MAP kinases . . . . . . . . . . . 222, 224–225, 227, 229
Phycoerythrin (PE) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144, 150, 164
Placenta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22, 97
Plasmid

construct . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36, 114
vector . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

Pluripotency . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2, 200
Pluripotent cells . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Polymerase chain reaction (PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6, 25
Polyploid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126
Primary cortical neuron cultures . . . . . . . . . . . . . . . . .221–231
Primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) . . . . 4, 19–26
Primitive streak . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Prolactin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 208
Pronase . . . . . . . . . . . 106, 110, 186, 211, 213–214, 216, 219
Purkinje neurons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 234

R

Receptor tyrosine kinases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221
Regenerative medicine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2, 190
Reporter genes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2, 136
Retinoic acid . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
RNA

antisense . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
interference (RNAi) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57–69
short interfering (siRNA). . . . . . . . . . . . . . . .66, 122, 198

RNAi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42, 48, 52, 55
RNA isolation . . . . . . . . . . . . . . 134, 136, 155–157, 166, 249

S

Sarcolemma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
Satellite cell . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30, 37, 41, 101–110
Self-renewal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2, 8–11, 31, 242
Septum transversum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
Serum

foetal bovine (FBS) . . . . . . . . . . . . .21–22, 73, 76–77, 84,
94, 103–104, 107, 189–190, 210, 244, 249–250

foetal calf (FCS) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5, 31, 114, 140
horse . . . . . . . . . . . . . .31, 36, 51, 103–104, 108, 114, 224

Skeletal muscle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29–55, 101–110
Skeletal muscle stem cell (SMSc) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29–55
Somites . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30, 64
SSEA1, 2
Stain

carmine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142, 158–160, 168
crystal violet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142, 154, 203

Page 262

MOUSE CELL CULTURE
Subject Index 257

Diff-Quik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129, 134–135
eosin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134–135
haematoxylin/hematoxylin . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134–135
Leishman’s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3, 5, 8–9, 33, 44
trypan blue . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211, 214

Stem Cell
embryonic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1–15
mammary epithelial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 157–160
neuronal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19, 222, 233–234
niche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31, 37, 126
skeletal Muscle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29–55

Stratified squamous epithelium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
Streptavidin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
Streptomycin . . . . . .6, 13, 21–22, 33–34, 59, 63, 73, 76, 84,

103–104, 114, 128, 140–141, 172–173, 177,
179, 191–192, 198–199, 210, 223

Subculture . . . . . 32, 38–40, 42–44, 47, 49, 53–54, 126–128,
131–132

See also Passage
Subventricular zone (SVZ) . . . 241–242, 246–247, 249–251
Sucrase–isomaltase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
Suspension culture . . . . . . . . 2, 4, 6, 11–12, 14–15, 141, 163

T

Tight junction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 208
Tissue chopper . . . . . . . . . . . . . . 142–143, 146–147, 162–163
Tissue-specific promoters . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
Tissue type

brain
cortex . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222, 226
hippocampus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 241
meninges . . . . . . . . . . . . . . . . . 222, 226, 235, 244, 245
ventricle . . . . . . . . . . . . . 207–208, 213–214, 218, 246

breast . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .139–140, 168
cardiac mesoderm. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
cardiac muscle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
central nervous system (CNS) . . . . . . . . . . 207–209, 234

See also Brain
choroid plexus

epithelium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 208–209
stroma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 213

connective . . . . . . . . 20, 40, 109, 147, 160, 173, 183, 222
epidermis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125, 129–130, 136
foregut endoderm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71, 92
homogenate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25, 66, 109
liver . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
lung

epithelium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72–73, 76
mesenchyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72–73, 76–78

mammary
epithelium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146, 159
fat pads . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142, 146, 159–160

neuronal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19, 222,
233–234, 241

pancreas . . . . . . . . . . . . . . . . 3–4, 82, 86, 91–98, 172–176,
178, 182–183

dorsal buds . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
regeneration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102, 106–107, 114
skeletal muscle . . . . . . . . . . . . . . . . . 29–55, 101–107, 109

dystrophic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31, 53
epaxial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30, 46
fibre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
hypaxial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30, 46

skin
dermis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
embryonic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45, 47, 61, 74
epidermis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .125, 129–130
neonatal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127, 129
stratified epithelium. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 125–126

spinal cord
floorplate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
roof plate . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

vascular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105, 218
Trachea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .72, 75–76, 78, 87
Transfection

efficiency . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132, 134
stable . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .51–52
transient . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51–52

Transfilter induction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
Transformation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
Transgene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2, 36, 42, 51–52
Transgenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
Transplant/transplantation

cleared mammary fat pad . . . . . . . . . . . . . . . 146, 159–160
See also Cell, transplantation

Transthyretin (TTR) . . . . . . . . . . . . . 208, 210, 212, 215–217
Trk receptors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 221–222
Troponin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101–102, 114
Trypsin . . . . . . . . . . . . . . . 5, 7, 21, 23–25, 32, 38–39, 53, 64,

106, 110, 128, 141–142, 147, 149, 163, 173,
179–180, 186, 223, 225, 227, 234–236, 243

β-tubulin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26, 242
Tumour suppressor . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

Trp53, 20–21
Tyramide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36, 51

U

Urinary . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
Uterus . . . . . . . . . . . 22, 45, 60, 74, 85–87, 95, 129, 244, 250

V

Vasculogenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
Vasopressin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 208
Ventricular chambers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
Ventricular hypertrophy. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .113
Ventricular myocardium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
Viral vectors

adenovirus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164, 172, 176, 180–183
lentivirus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .164
retrovirus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

Vitamin C. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
Voltage-gated calcium channels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .234

W

Water bath . . . . . . . . . . . . . . . . . 22, 24, 32, 37, 109, 115–116,
118–119, 132, 149, 174, 176, 181, 191–192,
236, 238, 250

Wholemount immunostaining . . . . . . . . . . . . . . . . . 82, 89, 93
Wholemount mammary preparation . . . . . . . 142, 159–160,

167–168
Wingless (Wnt). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .72

Y

Yolk sac . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22, 25

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