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HOPPE-SEYLER /TH IE RFE LDE R

HANDBUCH DER
PHYSIOLOGISCH- UND

PATHOLOGISCH-CHEMISCHEN
ANALYSE

FOR ARZTE, BIOLOGEN UND CHEMIKER

ZEHNTE AUFLAGE

HERAUSGEGEBEN VON

KONRAD LANG EMIL LEHNARTZ
MAINZ MONSTER

UNTER MITARBEIT VON

OTTO HOFFMANN-OSTENHOF GUNTHER SIEBERT
WIEN MAINZ

SECHSTER BAND I TElL C

Springer-Verlag Berlin Heidelberg GmbH 1966

Page 505

Pyruvat-Oxydase-f::lysteme. 493

zurtihren. Das ausgefallte Begleitprotein wird durch Zentrifugieren (30 min, 4000 X g)
entfernt (50ml Uberstand; spezifische Aktivitat 17-20; Ausbeute: 4000-5000E).

Der Uberstand wird nun durch Zugabe von 1m Phosphatpuffer, PH 5,9, auf eine
Phosphat-Konzentration von 0,1 m gebracht. Sodann wird 0,1 m Phosphorsaure tropfen-
weise und unter schnellem Umrtihren zugesetzt, his die ersten Anzeichen eines Pracipitates
sichtbar werden (PH 5,65-5, 7). Die Losung wird 15 min bei 5000 X g zentrifugiert. Der
Niederschlag wird in 10 ml 0,01 m Phosphatpuffer, PH 7,5, aufgenommen und der Uber-
stand durch weitere Zugabe von Phosphorsaure auf PH 5,4 gebracht. Das nunmehr er-
scheinende Pracipitat besitzt einen besonders hohen Reinheitsgrad, es wird durch Zentri-
fugieren entfernt und in der gleichen Weise in Phosphatpuffer gelOst (10 ml; spezifische
Aktivitat 35-50; Ausbeute: 1500-2500 E).

Auf diese Weise gewonnene Praparate oxydieren Pyruvat zu Acetat und C02 und sind
auBerdem zur nichtoxydativen Acetoinbildung befahigt. Das PH-Optimum liegt bei Ver-
wendung von Ferricyanid als Elektronenacceptor bei 6,4, bei Verwendung von moleku-
larem Sauerstoff zwischen 7,5 und 8,0. Die MICHAELIS-MENTEN-Konstante betragt
2 X I0-5 M Pyruvatfl. Coenzym A und DPN sind fur die Enzymaktion nicht erforderlich,
jedoch lauft die Reaktion nur bei Anwesenheit von TPP und Mg++ a b. Das Enzympraparat
verhalt sich elektrophoretisch und in der Ultrazentrifuge wie ein einheitliches Protein,
das Molekulargewicht liegt bei 4000000.

Bestimmung der Pyruvat-Oxydase nach JAGANNATHAN und ScHWEET1•
Prinzip:

Mit Ferricyanid als Elektronenacceptor laBt sich die Enzymaktivitat tiber die C02-
Bildung manometrisch in der WARBURG-Apparatur messen.
Reagentien:

1. 0,2 m Lithiumpyruvat.
2. 0,5 m NaHC03 •
3. 0,2 m MgCl2•
4. Thiaminpyrophosphat-Losung (TPP), 0,2 o/o ig, unmittelbar vor Gebrauch auf

PH 6,0 eingestellt.
5. 0,5 m Kaliumcyanoferrat (III).

A usfuhrung:
Mischl6sung. 0,5 ml Lithiumpyruvat, 0,1 ml NaHC03, 0,1 ml MgCl2 und 0,1 ml TPP-

Losung werden gemischt und mit C02 gesattigt. 0,8 ml dieser Losung werden mit der
EnzymlOsung, die etwa 50 E enthalt, in den Hauptraum eines W ARBURG-GefaBes gegeben.
Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,2 ml Kaliumcyanoferrat(III), welches in den
Seitenarm eingeftillt wird, gestartet. Gasphase : 100 % C02 • T = 38° C. End-pH-Wert
= 6,0.

Als Enzymeinheit wird die Enzymmenge bezeichnet, welche ein ,uM C02/Std freisetzt.
Spezifische Aktivitat: ,uMol C02/Stdfmg Protein.

Der Mechanismus der Pyruvatoxydation und die Art der benotigten Cofaktoren sind
bei der Oxydation durch Enzympraparate verschiedener Herkunft sehr unterschiedlich.
Das Pyruvat-Oxydase-System von Lactobacillus delbruckii erfordert fiir die Wirksamkeit
auBer TPP und Mg++, Mn++ oder Co++ zusatzlich anorganisches Phosphat oder Arsenat
und Flavinadenindinucleotid 2 • 3• Die oxydative Decarboxylierung verlauft phosphoro-
klastisch in folgender Reaktion 2• 4 :

CHa- CO- COO- + (OH)2 P02 + 0 2 -+ CHa-COOP03- + C02
1 JAGANNATHAN, V., and R. S. SCHWEET : J. biol. Ch. 196, 551 (1952).
2 LIPMANN, F.: Enzymologia 4, 65 (1937). Nature 143, 281, 436; 144,381 (1939). Cold Spring Harbor

Symp. quant. Biol. 7, 248 (1939).
a HAGER, L. P., D. M. GELLER and F. LIPMANN : Fed. Proc. 13, 734 (1954).
4 LIPMANN, F.: J. biol. Ch. 155, 55 (1944) .

Page 506

494 Thiaminpyrophosphat enthaltende Enzyme.

Bei Escherichia coli wird Pyruvat ebenfalls phosphoroklastisch oxydiert unter Bildung
von Acetylphosphat und Ameisensaure1- 5 :

CH3-CO- COO- + (OH)2P08-+ CH3- COOPo;- + HCOO- + H+
Das Enzym bzw. Enzymsystem lii.Bt sich mit Ammoniumsulfat zwischen 40 und 62%

Sattigung pracipitieren6 und benotigt fiir die Aktivitat neben TPP und Mg++ oder Mn++
anorganisches Phosphat.

Das Oxydase-System aus Clostridium butylicum katalysiert ebenfalls einen phos-
phoroklastischen Typ der oxydativen Pyruvatdecarboxylierung 7 ' s:

CH3-CO-COO- + (OH)zPOa-+ CH3 - COOPOa- + Hz + C02
Der phosphoroklastische Abbau ist kein Charakteristikum fiir Enzyme bakterieller

Herkunft. Das System von Proteus vulgaris 9 oxydiert Pyruvat zu Acetat und C02 und
laBt sich nach Ultraschall-Behandlung10 oder mechanischer Zerstorung der Zellen (Booth-
Green mill11 ) entweder durch hochtouriges Zentrifugieren gewinnen oder durch Essig-
saure bei PH 4,3 fiillen. Mit einem solchen Enzympraparat, welches ohne Zusatz von
TPP ohne Wirkung ist, da das Coenzym wahrend der Praparation vom Enzym abgetrennt
wird, besitzt Methylenblau als Elektronenacceptor etwa 10% der Wirksamkeit von mole-
kularem Sauerstoff. Das fiir die Enzymwirkung erforderliche zweiwertige Kation- wahr-
scheinlich Mg++- ist dagegen im Enzympraparat enthalten und laBt sich durch Dialyse
bei PH 4,0 und 0° C entfernen. Als Cofaktor wirken mit abnehmender Wirkung folgende
Metalle: Mn++, Mg++, Fe++ = Ni++, Zn++, Co ++. Ohne Wirkung sind: Ca++, Ba++, Cd++,
AJ++ + und Fe+++. Nach MoYED und O'KANE besteht das Enzym-System aus zumindest
zwei hitzelabilen Fraktionen12•

Inhibitoren. Wie eine starke Hemmung der Pyruvatoxydation durch das Enzym-
System von Proteus vulgaris unter Einwirkung von Hg anzeigt, handelt es sich wahrschein-
lich urn ein SH-abhangiges Enzym12• Weitere Inhibitoren sind 3-Fluor-pyruvat (Enzym
aus TaubenbrustmuskeJ13 •14), 2,2-Dichlor-propionat (Streptococcus faecalis und Proteus
vulgaris15), Furacin (Taubenleber16, Rattenhoden16, TaubenbrustmuskeJ17) sowie das Gift
der Kobra und der Russel-Viper18•

a-Ketoglutarat-Oxydase-Systeme.

Der Mechanismus der oxydativen Decarboxylierung von cx-Ketoglutarat ist demjenigen
von Pyruvat sehr ahnlich (s. S. 490 f.). Beide enzymatischen Reaktionen benotigen ex-Lipon-

1 KALNITSKY, G., and C. H. WERKMAN: Arch. Biochem. 2, 113 (1943).
2 UTTER, M. F., and C. H . WERKMAN: Arch. Biochem. 2, 491 (1943); o, 413 (1944).
a UTTER, M. F., F. LIPMANN and C. H. WERKMAN: J. biol. Ch. 168, 521 (1945).
4 STRECKER, H. J., H. G. W ooD and L. 0. KRAMPITZ: J. biol. Ch. 182, 525 (1950).
6 CHANTRENNE, H., and F. LIPMANN: J. biol. Ch. 187, 757 (1950).
6 STILL, J.L.: Biochem. J. 35,380 (1941).
7 KOEPSELL, H. J., and M. J. JOHNSON: J . biol. Ch. 145, 379 (1942).
8 KOEPSELL, H. J., M. J. JOHNSON and J. S. MEEK: J. biol. Ch. 154, 535 (1944).
9 STUMPF, P. K . : J. biol. Ch. 159, 529 (1945).

10 STUMPF, P. K., and D. E. GREEN: J. biol. Ch. 1li3, 387 (1944).
11 BooTH, V. H., and D. E . GREEN: Biochem. J. 32, 855 (1938).
12 MoYED, H. S., and D. J. O'KANE: Arch. Biochem. 39, 457 (1952). J. biol. Ch. 195, 375 (1952);

218, 831 (1956).
13 PETERS, R. A.: Bull. Johns Hopkins Hosp. 97, 21 (1955).
14 GAL, E. M., A. S. FAIRHURST and R. E. SMITH: Biochim. biophys. Acta 20, 583 (1956).
16 REDEMANN, C. T., and R. W. MEIKLE: Arch. Biochem. 59, 106 (1955).
16 P AUL, M.F., H.E.PAUL, F.KOPKO, M. J.BRYSON and C.HARRINGTON: J.biol.Ch.206, 491

(1954).
17 PAUL, M. F., M. J. BRYSON and C. HARRINGTON: J. biol. Ch. 219, 463 (1956).
18 BRAGANCA, B. M., and J . H. QuASTEL: Biochem. J. 53, 88 (1953).

Page 1009

Uterus, Glycyl-L-leucin-
Dipeptidase C 61

Hyaluronidase B 1218
Oxytocinase C 219
Peptidasen C 81

2.7.7.9 UTP:IX-D-Glucose-1-
phosphat-Uridylyltrans-
ferase s. UDP-Glucose-Pyro-
phosphorylase B 604

Valin .A 743
.Abbau B 162
Biosynthese .A 751
Decarboxylierung C 505
Dehydrierung .A 7 57
Stoffwechsel B 512
Transaminierung B 440

L-Valin, Decarboxylierung
c 582

Valin-.Alanin-Transaminase
B 456

4.1.1.14 L-Valin-Carboxy-
Lyase s. Leucindecarboxylase
c 582

Valindecarboxylase C 582
D,L-Valylylglycin C 54
Vasopressin C 228
Vasopressinase C 228
Verona!, Wirkung auf adenylic

deaminases C 393
auf Carnosinase C 80

Versene, Wirkung auf .Aconitase
c 656

auf Leucinaminopeptidase
c 164

auf Polysaccharidphos-
phorylasen B 242

auf Prolidase C 78
Verstärkerprinzip .A 83
Virus-Hämagglutination

B 1241
Vitamin B6-.Antagonisten, Wir-

kung auf Kynureninase B 841
Vitamin B6-Mangel, Wirkung

auf Glutamat-Pyruvat-
Transaminase B 399

Vitamin B6-Conjugasen C 142
Vitamin K-Reductase .A 773
Volumetrie, Differential- .A 57

druckkonstante .A 57
Vorhautdrüse, Ratte-, ß-Glu-

curonidase B 1201

Wachstumshormon C 98
WARBURG-Gefäß .A 98
W ARBURGsche Grenzschicht-

dicke C 420
Wasserstoff, .Absorptions-

koeffizient .A 278
Wasserstoffperoxyd, Wirkung

auf 3-Phosphoglycerin-
aldehyd-Dehydrogenase
.A 598

auf ß· Thioglucosidase
B 1190

Sachverzeichnis.

Wasserstoffübertragung .A 10
WROBLEWSKY-Einheit .A 299
Wechselzahl .A 16
Weizenkeimlinge, .Acetyl-

carboxylase B 133
Hexokinase B 650
Pyruvat-Decarboxylase

c 483
UD PG-Fructose-Trans-

glucosylase B 297
UDPG-+Hydroxy-phenol-

Transglucosylase B 304
UDPG-+Phenyl-ß-glucosid-

Transglucosylase B 305
meso-Weinsäure .A 746
meso-W einsäure-Dehydro-

genase .A 792
aus höheren Pflanzen .A 747
aus Rinderherzmito-

chondrien .A 746

xanthine C 395
Xanthinoxydase .A 171,854

of milk .A 883
1.2.3.2 xanthine: 0 2 oxido-

reductase s. Xanthinoxydase
.A 883

Xanthurensäure, Bildung
B 442

xylan B 1152
xylanase B 1152
3.2.1.8 xylan 4-xylanohydro-

lase s. xylanase B 1152.
Xylit .A 704

Wirkung auf Mutarotase
c 714

1.1.1.9 Xylit: N.AD-Oxydo-
reductase (n-Xylulose-
bildend) s. DPN -Xylit-
(-n-Xylulose)-Dehydrogenase
.A 710

1.1.1.10 Xylit:N.ADP-Oxydo-
reductase (L-Xylulose-
bildend) s. TPN-Xylit-
( -L-Xylulose)-Dehydrogenase
.A 708

D-Xylodialdopentofuranose
.A 721

n-Xyloketose, Glucosyl-
acceptor B 227

D-Xylonsäure .A 761
Xylose, Oxydation .A 249
n-Xylose .A 761

Abbauweg C 625
Dehydrierung .A 761

L-Xylose, Wirkung auf Mutaro-
tase C 715

n-Xylose-Isomerase C 625
IX·D-Xylose-1-phosphat B 227
xylose xylulose Isomerase C 722

activators C 726
assay methods C 723
inhibitors C 726
preparation C 723
specificity C 725

Xylulokinase B 686
Bestimmung B 688
Darstellung B 686
Eigenschaften B 687

n-Xylulokinase C 525
D-Xylulose .A 704, 721

Phosphorylierung B 686
L-Xylulose .A 723, 845
D-xylulose ketol-isomerase

c 722

997

Xylulose-5-phosphat B 209
.Acyloinspaltung C 481

n-xylulose-5-phosphate C 733
4.1.2.9 D-Xylulose-5-phosphat-

D-Glyceraldehyd-3-phospha t-
Lyase (phosphatacety-
lierend) s. Phosphoketolase
c 624

n-xylulose-5-phosphate ribu-
lose-5-phosphate isomerase
c 730

n-Xylulose-Reductase .A 715

yellow enzymes .A 854
determination .A 856

reaction mechanism .A 856
Y oshida-.Ascitestumorzellen

.A 143

Zellatmung .A 55
Zellhomogenate, P/0-Be-

stimmung .A 345
Zellpermeabilität .A 145
Zentralnervensystem, Kohlen-

säureanhydratase C 633
Zincon s.a. 2-Carboxy-1-

hydroxysulformazylbenzol
.A 641

Zink in Aldolasen C 615
in alkalischer Phosphatase

B 986
in Carboxypeptidase .A C 89
in Carboxypeptidase B

c 113
in Glutaminsäuredehydro-

genase .A 640
in Sperminoxydase .A 699

Zinkionen, Wirkung auf
adenylic desaminases
c 393

auf .Alkoholdehydrogenase
.A 351

auf Allantoinase C 377
auf .Aminosäureacylasen

c 138
auf .Anserinase C 83
auf .ATPase C 435
auf Carnosinase C 80
auf Cholinesterase B 919
auf Dehydropeptidasen

c 197
auf Desoxyribonuclease I

B 1067
auf Desoxyribonuclease II

B 1091

Page 1010

998

Zinkionen, Wirkung auf
Diaminoxydase A 691

auf Dipeptidase C 54
auf DOP A-Decarboxylase

c 537
auf DPN-L-Gulonat-

Dehydrogenase A 724
auf DPN -Xylit-(n-Xylu-

Jose-)Dehydrogenase
A 712

auf Exonuclease B 1024
auf Exonuclease III

B 1032
auf FAD-Pyrophosphory-

lase B 602
auf Flavokinase B 691
auf ß-Glucosidase B 1187
auf glutathione reductase

A 893
auf Glucose-6-phosphatase

B 993
auf o:-Glykosidasen B 1174
auf Glycyl-L-leucin-

Dipeptidase C 61
auf Hexokinase B 655
auf Hyaluronidase B 1221

Sachverzeichnis.

Zinkionen, Wirkung auf Kohlen-
säureanhydratase C 636

auf Kreatin-Kinase B 564
auf Kynurenin-o:-Keto-

glutarsäure-Trans-
aminase B 84 7

auf Leucinaminopeptidase
c 164

auf N5-N10-methylene
tetrahydrofolic dehydro-
genase B 191

auf Monoaminoxydase
A 665

auf 5'-Nucleotidase
B 1053

auf Oxytocinase C 224
auf n-Peptidasen C 183
auf Phosphodiesterase

B 1040
auf 3-Phosphoglycerin-

aldehyd- Dehydrogenase
A 596

auf Phosphomonoesterase
B 964,989

auf Phosphopyruvat-
Hydratase C 668

Zinkionen, Wirkung auf Poly-
saccharid phosphory lasen
B 243

auf Prolidase C 78
auf Protein-Kinase B 575
auf Pyridoxal-Kinase B 703
auf Ribonuclease B 759
auf Serinsynthetase B 875
auf Lll-Steroid-Dehydro-

genase A 547
auf Tryptophan-Synthe-

tase B 813, C 594
Zookinase C 122
Zoxazolamin, Hydroxylierung

A 1038
3.1.6.3 Zuckersulfat-Sulfo-

hydrolase s. Glykosulfatasen
B 1104, 1121

Zwei-Phasenextraktion A 346
Zweisubstratreaktion A 36

Bestimmung der Konstanten
A40

Gleichung A 37
Zwischenferment A 7, 8
Zymobacterium oroticum A 771
Zymohexase C 607, 718

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